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臨床致病菌同步PCR陣列(cPCR)檢測試劑盒


同步PCR陣列cPCR技術利用材料科學上的進步,使核酸引物合理固化在大分子表面,在超導納米粒子上進行固態化的反應。由此產生的cPCR是指能在一個相同的溫控擴增條件下進行單管多重、多管同步、重復的PCR反應體系;即該陣列在同一溫控條件下,多個反應管中進行PCR同步擴增,每個反應管內可以進行多重的PCR反應。 

 

Cogradient PCR ArraycPCRpolymerase chain reactions in tubes of a array set can work under a unique program of thermo-cycles。

                                                                                                      

 


一、細菌感染性疾病臨床的高發疾病

       細菌感染性疾病是臨床上發病率最高的疾病之一。從新生兒到老年人,每人每年可患上呼吸道感染一到數次,其發病率遠超于心血管疾病、腫瘤等疾病的總和。此外,在許多原發疾病的基礎上,繼發感染是導致死亡直接的原因。

 

二、細菌學診斷目前所面臨的挑戰

1.一次發病需要辨別的細菌基因數量日益增多;這是由于:

1可能導致感染的細菌種屬繁多;例如,呼吸道細菌感染可由多種細菌引起,大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、各種葡萄球菌、腸球菌、鮑曼不動桿菌、鏈球菌、流感嗜血桿菌、奇異變形桿菌共計10個菌屬約40余個致病菌種。

2細菌的各類耐藥基因種類繁多,如過半數的金黃色葡萄球菌菌株對苯唑西林、頭孢西丁、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松、慶大霉素、紅霉素、克林霉素等抗生素不敏感。

3某些細菌攜帶特殊的毒力因子;如某些金黃色葡萄球菌攜帶休克毒素(tst),殺白細胞素(pvl),直接影響疾病預后。

因此,臨床細菌實驗室所采取的每一標本而言,應采用具有快速性的基因擴增檢測技術,一般應能達到同步辨析102-103個目標的能力。

2.當前臨床細菌檢驗技術中存在的主要問題是方法的限制。

       我國目前診斷試劑市場中微生物診斷試劑所占的比重極低,僅為4-5%。傳統的檢測技術由細菌培養法、生物化學鑒定法和藥敏試驗構成。常被說成是從glass-wareplas-ware的繁瑣勞累的工作;造成一些細菌檢測常規項目,臨床難以開展。采用自動化細菌培養儀進行快速、自動化、高通量的分析,其原理仍是基于傳統的細菌培養法和生物化學鑒定法,一是價格高昂,二是仍然需要經過增菌-分離-培養鑒定的步驟,檢測時間一般仍需72小時以上;無法為早期治療提供依據。此外,這類方法無法探測細菌的毒力因子。

從方法學方面考慮,傳統的細菌生化檢測技術和分子生物學PCR檢測技術在臨床細菌鑒別結果上的重疊率為75-80%,宜同時使用、相互補充印證檢測結果。

3.方法學的創新方向需要建立一種多目標快速同步檢測方法,自得到細菌DNA2小時內,準確判別臨床常見10個菌屬大約40病原菌種屬、毒力及耐藥性,做到全方位快速診斷。

 

三、目前市場上已有的分子診斷產品

       PCR檢測技術依據的是微生物的核酸序列,具有高度準備性和敏感性;但該方法目前也被一些問題困擾。

1.普通熒光PCR試劑:目前市售的試劑盒一般都是對某一特定的目的基因進行擴增,每個試劑盒都有特定的溫度循環;普通PCR診斷產品較低的覆蓋面無法滿足同時進行102-103個目標基因的診斷。
       2.多重PCR試劑:共分兩種,一種是一個反應管進行多重(一般58個靶標)反應,但需要開蓋,后處理包括進行電泳或分子雜交以識別被擴增的分子,此方法增加了超級氣溶膠污染的機會;另一種方法無需開蓋,主要依賴對體系內多種熒光標記探針的識別,試劑及儀器的費用較高。多重PCR方法最大的詬病是多重擴增分子在體系中的互不兼容。
       3.Rep-PCR:完成PCR反應后必須進行開蓋處理,不但增加污染的幾率,還需使用額外的儀器設備和試劑,消耗更多的時間和經費。
       4.基因芯片:特定探針已固化在芯片表面,樣本需先經過前處理如熒光標記或PCR擴增,再開蓋,芯片上的探針反應。同前面的方法比較,不具顯著優勢。

 

四、我公司的cPCR陣列技術及其產品的操作模式

       1cPCR采用了溫度循環匹配的新型引物體系,這種體系使所有的分子擴增反應都遵循一個溫控程序,克服了“溫度循環條件的多重歧義路徑”這一關鍵性的限制。在熒光擴增儀上,一個反應流程即可快速檢測102-103個基因目標,具有同步解析多個目標的能力。也就是說,針對眾多目標基因PCR,都可以在任意一臺熒光擴增儀器上,按表1.所示,兩個小時之內完成擴增并判定結果。如果采用386孔擴增儀,可一小時內完成對10個菌屬40個臨床常見菌的300多個目標基因的同步檢測,一個反應流程即可區分出細菌的多種遺傳特性。

 

1. cPCR擴增溫度程序

步驟

溫度

循環數

預變性

95℃,10 min

1

變性--退火延伸

95,15s---61,60s

5

95,15s---62,60s

5

95,15s---64,60s

5

95,15s---65,60s

5

95,15s---66,60s

5

95,15s---67,60s

15

 

       2 按照細菌的種屬、毒力和耐藥性,我公司建立一個基因數據庫,包括臨床常見的10個菌屬的全部可探測的相關靶點,涵蓋各種致病菌的種屬特異性基因、耐藥性基因和毒力因子基因。

       3 在疾病檢測時,可根據種屬情況選擇相關基因;如需要檢測的菌屬較多,可用兩步以節省操作費用,即先作種屬測定,依照結果再檢測其他項目。具體內容請參考[疾病索引][用戶指導手冊]。

       4 操作僅需使用市場通用的熒光擴增儀,無其他特殊處理或輔助儀器。

       5 方法進行種內分型或分群,了解待檢菌致病性的強弱。

 

五、cPCR技術及其產品的優勢

改變了傳統方法耗時(time-consuming)、費力(labor-intensive)的特點。

1.操作簡便、時間短:樣本前處理簡單,操作準備 + PCR僅需不到2小時,即可完成對常見感染菌的各項診斷;PCR結束后無需開蓋。

2.利用通用熒光擴增儀,添加其他設備。

3.機動靈活:可根據需要自選擇待測基因組合;或利用分步法,先作種屬測定、依照結果再作其他項目,以節省費用。

 

如果從費效比的角度考察一個合格的醫學檢驗產品,對醫患二者而言其關鍵在于檢驗所需的時間費用;對檢驗人員勞動時間、操作的繁瑣程度、是否需要復雜的儀器操作及維護技能。在細菌分子檢測領域,cPCR在上述任何一個方面都顯著優勢,有可能取代目前市場上流通產品。

 

 

 

ATGeobioTM致病菌cPCR 檢測系列價格


檢測對象

代碼

應選擇的產品

規格

企業標準

臨床常見菌種屬

CB010

臨床常見致病菌種屬鑒定基因試劑盒

20T

Q/ATGeobio 010-2017

葡萄球菌屬

CB008

葡萄球菌屬種屬鑒定相關基因試劑盒

20T

Q/ATGeobio 008-2017

金黃色葡萄球菌臨床致病基因

CB009

金黃色葡萄球菌臨床相關基因試劑盒

20T

Q/ATGeobio 009-2017

 

《葡萄球菌屬可檢測基因數據庫》 見“技術文獻”板塊

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